D-(+)-苹果酸，又称羟基丁二酸或羟基琥珀酸，是自然界中存在稀少的一种有机酸，主要应用于手性药物合成、手型添加剂和手型助剂等领域，例如抗生素、抗病毒药物、抗癌药物、D-或L-肉毒碱和维生素(R)-泛酸等合成中的应用，也可作为配体合成药物拆分剂。本文将介绍一种利用生物酶法合成D-(+)-苹果酸的方法[1]。
背景技术
目前合成D-(+)-苹果酸的方法主要有化学拆分法、生物酶拆分法和生物酶法。其中，化学拆分法合成D-(+)-苹果酸的成本高，不利于工业化生产；生物酶拆分法合成D-苹果酸的生产浓度很低，远远达不到工业化要求；生物酶法转化合成D-苹果酸的研究报道最经济的，路线是从马来酸转化合成D-苹果酸。然而应用这些从自然环境中筛选的微生物进行生物酶法合成D-苹果酸时，菌种发酵生物量非常低，最高OD660有4.5，严重制约着工业化生产。
合成步骤
A.利用大肠杆菌Rosetta(DE3)作为宿主菌，共表达来源于产碱假单胞菌的马来酸水合酶的大小亚基PaHbzI和PaHbzJ，获得共表达马来酸水合酶大小亚基PaHbzI和PaHbzJ的大肠杆菌工程菌pETDuet-PahbzI-PahbzJ/Rosetta(DE3)，即DHIJ工程菌；
B.通过生物发酵DHIJ工程菌获得大量表达马来酸水合酶大小亚基的湿菌体，再利用湿菌体全细胞转化马来酸合成D-(+)-苹果酸。
技术优势
此方法所构建工程菌DHIJ稳定性好，易于培养，发酵周期短(18-20小时)，比已知用于酶法合成D-苹果酸的菌种发酵时间短接近10小时；发酵生物量高(120-140g/L，OD600为60-70)，比目前报道的用于酶法合成D-(+)-苹果酸的菌种发酵生物量最高OD616为4.5高太多，大大节约了发酵成本。
采用“一锅法”进行生物酶法合成D-(+)-苹果酸的工艺简单，易于操作，转化周期短(16小时内)，比目前报道的转化时间短10小时，节约大量人力和电力。
参考文献
[1] 一种生物酶法合成d-苹果酸的方法. Patent No. CN109402184A