β-半乳糖苷酶（英语：β-galactosidase）是一种水解酶，催化β-半乳糖苷水解成单糖。使β-半乳糖苷酶作用的底物包括神经节苷脂GM1、乳糖苷、乳糖、各种糖蛋白。
功能与特性
β-半乳糖苷酶是一种糖苷外切酶，专门水解在半乳糖和其有机部分之间的β- 糖苷键。它也可能裂解岩藻糖和阿拉伯糖所形成的糖苷，但是效率比较低。 它是人体中所必需的酶。 在此蛋白质不足的情况下可能导致Galactosialidosis(为一种溶酶体储积病)或莫尔基奥乙综合征。在大肠杆菌中的β-半乳糖苷酶的基因--lacZ的基因为诱导型系统的一部分，乳糖操纵子是于低血糖时在乳糖的存在下被激活。
分子生物学中经常使用β-半乳糖苷酶作为监测基因表达的指标印记。β-半乳糖苷酶也表现出蓝/白筛选重组复制中称之为α-互补形成的现象。这种酶可以分开为二种胜肽，分别为LacZ基因α和LacZΩ，这两者自身份别都不是反应端，但是当两者同时存在时，会自发地重新组合成一个有功能的酶。 这个特性被利用在许多复制载体(克隆)，其中在有lacZα基因的质体表现可以将实验室的大肠杆菌病株中的LacZΩ基因转换为另一个突变基因。然而，当DNA片段插入到载体中，制作LacZα的被打乱，因此细胞没有表现β-半乳糖苷酶的活性。β-半乳糖苷酶活性表现的存在与否可透过X-gal的检测来判断，如果质体没有插入此外来基因，就能成功表现出β-半乳糖苷酶的活性，就能成功分解X-gal，使菌落成为蓝色。反之，插入外来基因的质体无法分解X-gal(因为β-半乳糖苷酶无法表现)，而成为白色的菌落。
1995年，由Dimri等人。提出了β-半乳糖苷酶具有在PH 6.0 的新亚型（衰退与β-半乳糖苷酶和SA-β-半乳糖苷酶(衰老)有关）这被拿来特别表达老化（细胞的不可逆的生长停滞）。具体的定量测定法甚至开发了他的感应检测。然而现在已经知道，这是溶酶体内源β-半乳糖苷酶的积累，而使其过度表现不需要的衰老。尽管如此，它仍然是最广泛使用在衰老以及衰好细胞的生物标记物，因为它具有相当可靠的和容易检测之特性。
结构
24个氨基酸中的β-半乳糖苷酶最初是在1970定序出来，而其结构是在24年后，也就是1994年确定该蛋白是一个464 - kDa的 同源四聚体与2,2,2点对称性且每个单元的β-半乳糖苷酶包括了五个领域 ; 区域是胶卷型桶，第二区域和第四区域为纤连蛋白III型状的桶，第五区域是β-三明治型，而中央的第三区域是TIM型桶。
活性端位于第三个结构域。活性端是由四聚体两个亚基的元素所组成的，并且在四聚成二聚体活性端的解离除去中的扮演关键要素。β-半乳糖苷酶的末端序列中，α-肽参与了于亚基界面中的的α-互补。其残基22-31帮助以稳定的四螺旋束形成该界面的主要结构，残基13和15则有助于激活接口。这些结构上的特征为为α-互补的现象，为缺失的氨基末端片段的结果在非活性二聚体的形成提供一个合理的解释。
催化反应
β-半乳糖苷酶的活性端通过“浅层”与“深层”结合基质来催化水解双糖。一价的钾离子（K +），以及二价的镁离子（镁2 +）需要酶的活性。以β-核苷间键为基质经由谷氨酸侧链上的羧基终端裂解而成。 在大肠杆菌中，谷氨酸-461被认为是取代反应的亲核试剂。然而，现在已经知道谷氨酸-461是一种酸[催化剂]。相反的，谷氨酸-537为实际的亲核试剂，他是结合到半乳糖的中间体。
在人类中，是由Glu-268扮演水解反应的亲合试剂。
β-半乳糖苷酶所催化的反应